Análisis multiplexado de ácidos nucleicos para la identificación de nuevos biomarcadores de enfermedad

Gracias al avance de diferentes tecnologías, en la actualidad es posible relacionar muchas patologías con su causa genética. Esto ha permitido el desarrollo de tratamientos específicos y alcanzar una mejor comprensión de la fisiopatología y de la evolución clínica de determinadas enfermedades. A pesar de este avance, en muchos casos sigue siendo difícil la detección precoz de la enfermedad o poder llevar a cabo un adecuado seguimiento de la misma en respuesta a diferentes tratamientos.

 

Una de las maneras de abordar y tratar de superar estas limitaciones ha sido la búsqueda de nuevos biomarcadores. Sin embargo, en muchas ocasiones no es un único marcador, sino la combinación de varios biomarcadores lo que nos proporciona la información clínicamente relevante. La aparición de las tecnologías de análisis multiplexado, como xMAP® y xTAG® de Luminex, han permitido que esta labor sea mucho más eficiente dando a los investigadores la posibilidad de llevar a cabo la evaluación de manera simultánea de múltiples analitos, con una menor cantidad de muestra de partida, y disminuyendo el error pre-analítico derivado de tener que realizar varios pasos previos antes de la medición.

 

Entre otras aplicaciones, la tecnología xTAG® permite estudiar la expresión diferencial de genes gracias a la cuantificación relativa de ARN mensajeros (ARNm). Esta tecnología puede describirse como una consecución de cuatro sencillos pasos: 1) Lisis de las células o tejido de partida, 2) Incubación con sondas específicas para los ARNm de interés durante la noche, 3) Amplificación de la señal usando la tecnología branched-DNA (bDNA)1, y 4) Adicción de un sustrato quimioluminiscente de manera que la señal medida es directamente proporcional a la cantidad de ARNm de partida presente en la muestra (Figura 1).

Figura 1. Flujo de trabajo en la tecnología xTAG® de Luminex.

Como material de partida se pueden utilizar diferentes tipos de muestras:

 

  • ARN purificado
  • Cultivos celulares
  • Sangre total
  • Sangre seca sobre papel
  • Muestras frescas o congeladas
  • Muestras parafinadas

Además, es importante destacar que este tipo de análisis es especialmente apropiado para muestras degradadas (ej. muestras FFPE), lo que supone una gran ventaja frente a otras técnicas, como la secuenciación masiva o Next-generation Sequencing (NGS), que requieren un material de partida de excelente calidad.

 

Finalmente, el estudio de expresión diferencial de genes mediante la cuantificación relativa de ARNm tiene una amplia variedad de aplicaciones, entre las que figuran:

 

  • Verificación de biomarcadores.
  • Validación de genes encontrados por CHIP o NGS.
  • Subclasificación de tumores2.
  • Análisis retrospectivo de muestras en parafina o en teñidas sobre cubre-objetos.
  • Análisis de xenografts.
  • Detección de translocaciones y genes de fusión.
  • Test toxicológicos.

BIBLIOGRAFÍA

  1. Graham H, et al. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 2019 Apr 1;158:2-11.
  2. Baldacchino S, et al. Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material. J Vis Exp. 2018 Aug 1;(138):57148.

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